Durch die DAkkS nach DIN EN ISO 15189:2023 akkreditiertes Labor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-ML-19493-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Durch die DAkkS nach DIN EN ISO 15189:2023 akkreditiertes Labor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-ML-19492-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Durch die DAkkS nach DIN EN ISO/IEC 17025 akkreditiertes Prüflabor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-PL-19492-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Stand:
19.04.2024
Der APC-Resistenz liegt in über 90 Prozent der Fälle eine Punkt-Mutation im Faktor-V-Gen (G1691A; Faktor V-Leiden) zugrunde. Die Mutation ist mit einem hohen Risiko für Thromboembolien assoziiert, in der heterozygoten Form mit einem 5- bis 10-mal, in der homozygoten Form mit einem 80- bis 100-mal höheren Thromboserisiko.
Protein C besitzt eine antikoagulatorische Wirkung. In Gegenwart von Thrombin und Thrombomodulin wird Protein C aktiviert. Das aktivierte Protein C spaltet den aktiven Faktor Va der Gerinnungskaskade in die inaktive Form, wodurch letztlich eine antikoagulatorische Wirkung entsteht. Faktor V-Leiden ist aufgrund der Mutation resistent gegenüber der Inaktivierung durch Protein Ca und behält somit seine prokoagulatorische Aktivität wodurch das Thromboserisiko steigt.
Indikation zur Untersuchung auf APC-Resistenz und Faktor V-Leiden:
Der Nachweis einer APC-Resistenz kann durch einen funktionellen Test im Plasma (Phänotyp) und durch den Nachweis der verursachenden Mutation auf DNA-Ebene (Genotyp) erfolgen.
Koagulometrie:
Der funktionelle Test wird als Screeningtest primär durchgeführt.
Die Analyse erfolgt mittels aPTT-Test mit und ohne Zusatz eines Protein C-Aktivators. Die beiden gemessenen Gerinnungzeiten werden ins Verhältnis gesetzt. In einem Normalplasma verlängert sich die Gerinnungszeit der aPTT bei Zusatz eines Protein C-Aktivators um den Faktor 2 oder größer. Liegt ein Faktor V-Leiden vor, so ist die Inaktivierung des Faktor V ungenügend und die Verlängerung der Gerinnungszeit fällt niedriger aus.
LAMP:
LAMP ist eine DNA-Amplifikation Technik, die eine isothermale Nukleinsäureamplifikation verwendet, sodass der Nachweis einer Zielsequenz ohne Thermocycler erfolgen kann, wie es bei konvenzionellen PCRs oder real-time PCRs von Nöten ist. Im Rahmen der LAMP wird die Zielsequenz bei einer konstanten Temperatur von 65 °C amplifiziert. Es werden 3 Primerpaare benutzt, sowie eine Polymerase, die neben der Replikationsaktivität auch eine hohe Strangverdrängungsaktivität hat. Es werden 6 verschiedene Primer verwendet, um 8 verschiedenen Regionen des jeweiligen Zielgens zu identifizieren, was die Spezifität erhöht. Aufgrund der spezifischen Wirkungsweise dieser Primer ist die produzierte DNA-Menge erheblich höher als bei der konventionellen PCR-basierten Amplifikation. Die Pyrophosphat-Freisetzung führt zur Prezipitation, was als Trübung erkennbar ist.
Das Lamp Human FV LEIDEN KIT (rs6025) enthält 6 spezifische Primer, die eine loop mediated Amplifikation der spezifischen Region, die den FVL G1691A-Polymorphismus umgibt, ermöglichen. Jede amplifizierte Zielsequenz wird mittels Wildtyp spezifischer Sonde durch die Detektion von Fluoreszenz-Quenching detektiert. Nach der Amplifikation wird die Temperatur auf 40 Grad erniedrigt und die Sonde hybridisiert an die amplifizierte Zielsequenz, wobei Reporter- und Quencher-Farbstoff in unmittelbarer Nähe stehen, was im Quenching der Fluoreszenz resultiert. Während der Schmelzkurvenanalyse steigt die Temperatur bis 90°C und die Fluoreszenzemission wird gemessen. Das amplifizierte mutierte DNA-Fragment stimmt nicht perfekt mit der Wildtyp-spezifischen Sonde überein. Die Sonde wird bei niedrigerer Temperatur vom mutierten Fragment freigesetzt, als vom amplifizierten Wildtyp-DNA-Fragment. Das ermöglicht die Differenzierung zwischen einem homozygot mutierten, heterozygot mutierten oder Wildtyp Faktor II-Genfragment.
Gerät: LC Genie III v3.17
Kit: Lamp Human FV LEIDEN KIT (rs6025)
Störfaktoren können das Messergebnis der Koagulometrie beeinflussen:
Probenstabilität des Citratplasmas:
4 Stunden bei RT
24 Stunden bei 2-8 °C
Gendiagnostikgesetz (GenDG):
Das (GenDG) fordert für alle genetischen Untersuchungen eine ausführliche Aufklärung des Patienten sowie eine schriftliche Einwilligung.
Einverständniserklärung med.-genetische Untersuchung.pdf
Die Untersuchung erfolgt außerhalb der Akkreditierung.
Beurteilung:
Eine Ratio über 2,0 im APC-Resistenz-Assay wird bei Gesunden gefunden
eine Ratio ca. zwischen 1,3 und 2,0 bei heterozygoter Faktor-V-Leiden-Mutation
eine Ratio ca. unter 1,3 bei homozygoter Faktor-V-Leiden-Mutation.
Mittels der LAMP ist eine Differnzierung zwischen heterozygoter und homozygoter Mutation möglich und somit eine Einschätzung des Thromboserisikos.
Der positive Nachweis einer Faktor V-Leiden-Mutation bestätigt die genetisch bedingte APC-Resistenz.
Literatur: