16SrRNA-Gensequenzierung

Indikation

Verdacht auf Infektion mit bakteriellen Erregern.

In Spezialfällen zeigt die Kultur aus klinischen Materialien trotz Vorhandensein eines Erregers kein Wachstum. Ursächlich kommen eine vorausgehende antibiotische Therapie sowie Bakterien mit speziellen Wachstumsbedingungen infrage wie z. B. Anaerobier oder Bakterien, die anspruchsvoll bezüglich der Kulturbedinungen sind. Bei solchen Erregern kann durch die Anwendung einer 16S-rRNA-PCR eine Identifikation erreicht werden.

Das 16S rRNA-Gen kodiert für ein RNA-Fragment, das in der kleinen Untereinheit prokaryotischer Ribosomen vorkommt. Alle Bakterien besitzen dieses Gen, welches hochkonserviert ist. Daher kann ein Abschnitt dieses Gens durch ein Primerpaar aus allen Bakterien amplifiziert werden. Durch Sequenzierung nach Sanger wird die genaue Basenabfolge bestimmt, die in den verschiedenen Spezies unterschiedlich ist. Die Sequenzanalyse des 16S-rRNA-Gens ist eine universell einsetzbare Technologie für die Identifikation von Bakterien.

Methode

Es erfolgt eine PCR in dem eine spezifisches Fragment des Zielgens amplifiziert wird.

Der Nachweis dieses Amplifikates erfolgt mittels Agarosegelelektrophorese und zeigt das Vorhandensein bakterieller DNA an.

Anschließend erfolgt die Sequenzierung nach Sanger.

Durch eine Datenbankanalyse der erhaltenen Sequenz kann der spezifische Erreger, bzw. die Erregerfamilie ermittelt werden.

Gerät: Genetic Analyzer (ABI)

Material

Kultur und Abstriche, respiratorische Materialien, Explantate, Herzklappen, Gewebe, Liquor,Blut; DNA

Benötigtes Probenvolumen: mindestens 500 µl

Präanalytik

Das Untersuchungsmaterial wird direkt nach Probeneingang bearbeitet oder bei -20 °C gelagert. Vollblut und Gewebe werden bei +4°C gelagert.

Hinweise

Es kann nur primär steriles Material eingesetzt werden. 

Sind mehrere bakterielle Erreger in einer Probe enthalten, so kann zwar in der PCR ein Amplifikat erhalten werden, welches sich nach Sequenzierung aber nicht differenzieren lässt.

Bei geringer Keimkonzentration kann möglicherweise kein Amplifikat erzeugt werden.

Sequenzidentitäten werden nur interpretiert, wenn diese zwischen ≥97% und  <99% liegen. Dann darf der Genus angegeben werden. 

Sequenzidentitäten die <97 % liegen, sind zu unspezifisch um einem bakteriellen Erreger zugeordnet werden zu können.

Bei Sequenzidentität ≥99% wird der Erreger auch auf Speziesebene angegegeben.

Sonstiges

KR_MB_FB_Konformitätserklärung 16S rRNA-Sequenzierung

Literatur

Goldenberger et al., J. Clin. Microbiol. 1997; 35:2733-9