Durch die DAkkS nach DIN EN ISO 15189:2023 akkreditiertes Labor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-ML-19493-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
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Durch die DAkkS nach DIN EN ISO/IEC 17025 akkreditiertes Prüflabor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-PL-19492-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Stand:
19.04.2024
Bei der serologischen Bestimmung von Blutgruppenmerkmalen, bzw. Antigenstrukturen, können ungewöhnliche oder seltene Strukturen serologisch nur unzureichend differenziert werden. Hier bietet sich eine Untersuchung auf genetischer Ebene an.
Mit dem eingesetzten Testverfahren können Antigenmerkmale auf Erythrozyten (RBC), Leukozyten (HLA) oder Thrombozyten (HPA) detektiert werden.
Die molekularbiologischen FluoGene Detektionssysteme von inno-train bauen auf der PCR-SSP (SSP: „Sequence Specific Priming“) auf. Die Polymerasekettenreaktion oder Polymerase Chain Reaction (PCR) ermöglicht eine Anreicherung (Amplifikation) von definierten DNA-Sequenzen. Nach erfolgreicher Amplifikation der genomischen DNA-Targetsequenz liegt diese in nachweisbarer Konzentration vor. SSP ist eine Variante der PCR, bei der für eine Spezifikation des bestimmbaren Merkmals ausschließlich die Sequenz des Primers am 3´ Ende verantwortlich ist. Für eine vollständige PCR-SSP Analyse werden mehrere Amplifikationen parallel durchgeführt. Ansätze mit Primerbindung zeigen nach PCR ein spezifisches Amplifikat, Ansätze ohne diese Bindung hingegen nicht. In jedem Reaktionsansatz (Well) befinden sich neben den spezifischen Primern auch Primer zur Amplifikation einer internen Kontrolle (Gensequenz des Humanen Wachstumshormons, HGH). Falls kein spezifisches Produkt nach PCR vorliegt, muss das Amplifikat dieser internen Kontrolle nachweisbar sein. Der Nachweis der PCR-Produkte erfolgt über die Messung von Fluoreszenzsignalen.
Jeder PCR-Ansatz enthält mindestens zwei in ihrem Emissionsspektrum unterscheidbare und an Oligonukleotidsonden gekoppelte Fluorochrome: mindestens ein Marker für die spezifischen Amplifikate und ein Marker für die interne HGH-Kontrolle.
Die Fluoreszenzdetektion kann als Endpunkt-Methode im Fluoreszenzreader (inno-train FluoVista) oder in Echtzeit während des PCR-Laufs im Real-Time PCR Gerät (inno-train FluoQube) erfolgen.
Bei der Endpunktdetektion werden vor und nach PCR die Emissionen der verschiedenen Fluorochrome im FluoVista detektiert und die Differenz mithilfe der FluoGene Auswertesoftware ermittelt. Im FluoQube wird der Anstieg der Emissionen der verschiedenen Fluorochrome während des PCR-Laufs detektiert. Aus diesen Fluoreszenzwerten sowie dem CT-Wert (Cycle threshold, Beginn des exponentiellen Wachstums einer Amplifikationskurve) werden die Q-Werte ermittelt. Diese werden mithilfe der FluoGene Auswertesoftware als positiv oder negativ bewertet. Der Anstieg der Fluoreszenz- bzw. der Q-Werte über spezifische Schwellenwerte spiegelt eine positive Amplifikation wieder.
RBC-FluoGene Testsysteme
Die RBC (Red Blood Cells)-FluoGene Testsysteme der inno-train ermöglichen eine molekulare Bestimmung der unterschiedlichen Blutgruppensysteme. Verschiedene, in PCR-Platten voraliquotierte und getrocknete Oligonukleotidmixe dienen zur Amplifikation der genetischen Merkmale.
1. RBC-FluoGene ABO basic
Verantwortlich für die antigenen Eigenschaften der erythrozytären ABO-Rezeptoren sind Zuckerbausteine. Diese Kohlenhydrate werden nicht durch DNA-Sequenzen kodiert, sondern von Enzymen synthetisiert. Die Sequenz kohlenhydratspezifischer Glykosyltransferasen kann wiederum über PCR identifiziert werden. Die ABO Glykosyltransferasen übertragen Zuckerreste auf die „H-Substanz“, so dass durch N-Acetyl-Galaktosamin A-Antigene und/oder durch Galaktose B-Antigene gebildet werden.
Das RBC-FluoGene ABO basic System ist in der Lage, die häufigsten Merkmale A, A2, B, O1 und O2 eindeutig voneinander zu unterscheiden.
2. RBC-FluoGene vERYfy
Dieses Testsystem eignet sich für die Typisierung unterschiedlicher Blutgruppensysteme. Serologisch befundete D-Ambiguitäten, unklare Blutgruppen polytransfundierter Patienten oder von Patienten, die Allo- oder Auto-Antikörper bilden und/oder einen positiven DAT Test zeigen, können mit diesem Kit gescreent und identifiziert werden.
Im Rhesus-System werden innerhalb des RHD-Gens die Exone 3, 5 und 10, sowie das RHD Pseudogen ψ (37 bp Insertion in Intron 3) detektiert, sowie die Allele C, c, E, e und Cw. Darüber hinaus werden mit diesem Kit die Blutgruppensysteme Kell (KEL1/KEL2), Kidd (JK1/JK2), Duffy mit den Allelen FY1(A), FY2(B), FYX und FYnull (GATA-box Mutation), MNS mit den Allelen MNS1(M), MNS2(N), MNS3(S), MNS4(s), U+var(P2) und U+var(NY) sowie Dombrock (DO1/DO2) typisiert.
3. RBC-FluoGene CDE
Für die Ausprägung der CDE Rhesusmerkmale sind zwei auf Chromosom 1 lokalisierte Gene, das RHD-Gen und das RHCE-Gen, verantwortlich. Beide Gene bestehen aus zehn Exonen. Während die Bezeichnung Rhesus klein d das Fehlen des kompletten RHD-Gens und somit auch des D-Rezeptors ausdrückt, sind die Merkmale CcEe durch Sequenzunterschiede im RHCE-Gen charakterisiert. Zusätzlich detektiert das CDE Testsystem die beiden RHCE SNPs 733C>G und 1006G>T, wodurch man Vorhersagen auf den abgeleiteten RH:10/RH:20 (V/VS) Phänotypen treffen kann. Die detaillierte Information, welche RHCE-Varianten diese SNPs aufweisen, ist der Spezifitätentabelle des jeweiligen Kits zu entnehmen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit bildet die Software lediglich eine positive Detektion des SNPs ab.
Neben den D-positiven und D-negativen Phänotypen kommt es in seltenen Fällen (0,2 bis 1% bei Europäern) zur Ausprägung von sogenannten D-Varianten. Hier unterscheidet man die Partial-D-Typen (z.B. D-Kategorien) und die Weak-D-Typen.
Das vorliegende CDE Detektionssystem ermöglicht durch den molekularbiologischen Nachweis der verschiedenen Exone des RHD-Gens die Unterscheidung eines „normalen“ D-Typs von den verschiedenen Partial-D-Typen.
Durch den Austausch eines oder mehrerer Exone des RHD-Gens gegen die korrespondierenden Exone des RHCE-Gens entstehen sogenannte Hybride. Die bekanntesten dieser Hybride werden mit dem vorliegenden System nachgewiesen.
Zusätzlich erlaubt das System die Detektion der Merkmale C, c, E, e und Cw.
Wie von internationalen Fachverbänden gefordert, werden mit dem FluoGene CDE System auch die allelischen Varianten des RHD psi und d(C)ces erfasst. Weitere Informationen zum Auflösungsvermögen sind der entsprechenden Spezifitätentabelle zu entnehmen.
4. RBC-FluoGene D weak/variant
Die weak D Merkmale sind Allele des RHD-Gens auf Chromosom 1 und unterscheiden sich in ihrer immunogenen Proteinstruktur (extrazellulär) nicht vom D-Antigen. Die molekulare Charakteristik der weak D Typen sind verschiedene Punktmutationen, die jeweils einen Aminosäureaustausch im intrazellulären- oder transmembranen Bereich des betroffenen Antigens bewirken. Allen weak D Merkmalen gemeinsam ist die gegenüber D-positiven Zellen verminderte Rezeptorendichte auf der Zelloberfläche. Die hierdurch geringere Konzentration von Rh/D-Epitopen auf der Erythrozytenmembran ist abhängig vom vorliegenden weak D Typ und kann zu einer sehr starken Abschwächung der Agglutination im klassischen Hämagglutinationstest führen. Durch Verwendung des FluoGene D weak wird eine eindeutige Bestimmung der häufigsten weak D Allele (Typ 1, 1.1, 2, 3, 4, 4.0, 4.1, 4.2 (DAR), 5, 14, 15, und 17) ermöglicht. Mindestens 95% aller beobachteten weak D Phänotypen können den weak D Allelen Typ 1 bis Typ 5 zugeordnet werden. Darüber hinaus werden die 3 häufigsten DEL Allele DEL(M295I), DEL(K409K) und DEL(IVS3+1G>A) detektiert.
HLA-FluoGene Testsysteme
Die HLA-FluoGene Testsysteme von inno-train ermöglichen mindestens eine niedrigauflösende Typisierung der HLA Klasse I (HLA-A*, -B*, -C*) sowie der HLA Klasse II (HLA-DRB1*, -DRB3*, -DRB4* -DRB5*, -DQA1*/DQB1*, -DPA1*/DPB1*) Merkmale hinsichtlich der „Common Allele“ (CWD 2.0 http://igdawg.org/cwd.html).
HPA-FluoGene Testsysteme
Die Humanen Plättchen Antigene (HPA) sind Glykoproteine der Thrombozytenmembran. Beim Auftreten von Antikörpern gegen HPA-Merkmale des Spenders können im Blut des Empfängers Immunreaktionen erfolgen, die eine Lyse der transfundierten Thrombozyten verursachen. In diesen Fällen benötigt der Patient Thrombozytenkonzentrate, die keine vom Antikörper erkannte Antigenstruktur besitzen.
Die HPA-Merkmale HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA-5, HPA-6, HPA-9 und HPA-15 treten jeweils in zwei unterschiedlichen Antigenstrukturen auf, die mit a und b bezeichnet werden. Die Ursache für diese allelischen Varianten sind einzelne Polymorphismen (SNPs), die zu einem Aminosäureaustausch führen.
Das HPA-FluoGene Testsystem der inno-train ermöglicht die genannten Polymorphismen eindeutig zu detektieren.
Bei der DNA Extraktion aus Vollblut dienen die Leukozyten als DNA Quelle. Es kann zur Methodendurchführung genomische DNA jeglicher Herkunft verwendet werden ( z.B. Haare, Gaumenabstrich etc.)
Lagerung der Proben bei 2 - 8 °C
Literaturangaben
1. Mullis KB, Faloona F: Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed chain reaction. Meth. Enzym. 1987;155:335-350
2. Newton CR, Graham A, Heptinstall E, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF: Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research 1989;17:2503-2516.
3. Olerup O, Zetterquist H: HLA DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR SSP) in two hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens 1992;39:225-235.
4. Bunce M, O´Neill CM, Barnardo MCNM, Krausa P, Browning MJ, Morris PJ, Welsh KI: Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens 1995;46:355-367.
5. Bunce M, Young NT, Welsh KI: Molecular HLA Typing – The brave new world. Transplantation 1997;64:1505-1513.