Clostridium difficile Stuhldiagnostik

Indikation

Clostridioides (früher Clostridium) difficile kommt ubiquitär in der Umwelt sowie im Darmtrakt von Tier und Mensch vor. Beim Menschen ist der Erreger häufig im Darm von Kleinkindern (bis zu 80%) aber vergleichsweise selten im Darm von Erwachsenen (≤ 5%) zu finden.
C. difficile verursacht ca. 15–20% der Antibiotika-assoziierten Durchfallerkrankungen und mehr als 95% der Fälle von pseudomembranöser Kolitis. Krankheitsauslösend wirken die Virulenzfaktoren Enterotoxin A und Cytotoxin B, die zu einer zytotoxischen Schädigung der Intestinalzellen und damit zu Diarrhö und Kolitis führen.
Der Erreger wird durch orale Aufnahme der Bakterien (Sporen) übertragen. Symptomatische Patienten scheiden große Mengen von Bakterien/Sporen mit ihrem flüssigen Stuhl aus. Somit können die Sporen direkt oder indirekt auf andere Personen übertragen werden.

Die Analysen werden im Zweistufenverfahren durchgeführt bei:

• Verdacht auf eine Clostridien-assoziierte Diarrhoe
• Therapie/Verlaufskontrolle einer bekannten Clostridien-assoziierten Diarrhoe

1. Der Nachweis des "Common Antigens" Glutamat Dehydrogenase (GDH) mittels CLIA ist hochsensitiv, aber wenig spezifisch, da auch nichttoxinbildende Stämme und andere Clostridienspezies detektiert werden. Dieser Test eignet sich wegen des hohen negativen prädiktiven Wertes als Screeningverfahren.

2. Bei einem positiven Ergebnis des "Commen Antigens" folgt die Durchführung eines weiteren Testes zur Absicherung der Spezifität.
Hierzu eignet sich ein CLIA zum Nachweis der Toxine A und B.

3. Bei fraglichen Befunden wird die PCR zum spezifischen Nachweis der Toxin-Gene zur entgültigen Abklärung durchgeführt.

Methode

Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA):

Nachweis von Glutamat Dehydrogenase (GDH) und Clostridien Toxin A und B.

Reagenzien:LIAISON® C. difficile GDH und Toxin A&B Assay 

Polymerase-Kettenreaktion:  

Zur Stufendiagnostik von C. difficile wird im letzten Schritt, nach positivem GDH- und negativem Toxin-ELISA, die PCR durchgeführt. Diese ermöglicht die Differenzierung zwischen einem toxigenen und nicht-toxigenen C. difficile Stamm.

Die Amplifikation und Detektion basiert auf dem TaqMan-Format.

Extrahierte DNA wird mittels PCR amplifiziert. Während des Annealings hybridisieren sowohl die beiden spezifischen PCR-Primer als auch eine, für dieses Detektionsverfahren erforderliche, spezifische fluorogene Sonde am nachzuweisenden Genom. Im gleichzeitig ablaufenden Elongationsschritt (Zwei-Schritt-PCR) wird diese Sonde von der 5`-3`Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase gespalten, wodurch das Fluoreszenzsignal ansteigt. Übersteigt das Meßsignal einen von der Software des Gerätes berechneten cut-off Wert, so gilt die Probe als "positiv" und der entsprechende PCR-Zyklus, in dem die Fluoreszenz diesen "threshold" übersteigt, wird als "threshold cycle" C_Tdefiniert.

Reagenz: RIDA-GENE CD Toxin A/B; R-Biopharm

Material

• frische Stuhlproben 

Präanalytik

Das Untersuchungmateriel sollte sofort zum Labor transportiert werden. Stabilität ist be Raumtemperatur für 4 Stunden gegeben. Eine sofortige Vorbereitung des Materials ist erforderlich für eine optimale Aussagekraft des Ergebnisses. Das Toxin zerfällt bei Raumtemperatur somit ist ein unverzüglicher Probentransport zum Labor unverzichtbar.

Hinweise

Beurteilung:

GDH ELISA → negativ;   Befund: kein Anhalt für C. difficile
        ↓ positv
Toxin ELISA → positiv;   Befund: Nachweis toxinbildenen C. difficile
        ↓ negativ
Toxin PCR   →  positiv;   Befund: Nachweis toxinbildenen C. difficile 
         ↓ negativ                     
           Befund: Nachweis eines nicht toxinbildenen C. difficile 

Bei negativem Ergebnis und weiterhin bestehendem Verdacht Wiederholung der Untersuchung

Sonstiges

Infektionsschutzgesetz:

Durch die Verordnung zur Anpassung der Meldepflichten nach dem Infektionsschutzgesetz an die epidemische Lage (IfSG-Meldepflicht-Anpassungsverordnung) wurde die Meldepflicht nach § 6 IfSG auf die Erkrankung sowie den Tod an einer Clostridium-difficile-Infektion mit klinisch schwerem Verlauf ausgedehnt.

Die Meldungen müssen dem Gesundheitsamt spätestens 24 Stunden nach erlangter Kenntnis vorliegen.

Literatur:

• Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie
  (Hrsg.: S. Suerbaum, G-D. Burchard, H.E. Kaufmann, T.F. Schulz)
  Springer Verlag 2020 9. Auflage 
  
  
• www.rki.de 
  RKI-Ratgeber
  RKI – Infektionskrankheiten A-Z