Durch die DAkkS nach DIN EN ISO 15189:2023 akkreditiertes Labor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-ML-19493-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Durch die DAkkS nach DIN EN ISO 15189:2023 akkreditiertes Labor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-ML-19492-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Durch die DAkkS nach DIN EN ISO/IEC 17025 akkreditiertes Prüflabor. Die Akkreditierung gilt nur für den in der Urkundenanlage D-PL-19492-02-00 aufgeführten Akkreditierungsumfang.
Stand:
15.01.2025
Prothrombin (Faktor II) wird über Faktor Xa und Va zu Faktor IIa aktiviert (Thrombin). Thrombin wandelt inaktives Fibrinogen (Faktor I) zu aktivem Fibrin um.
Die Prothrombinmutation (G20210A) verändert das Promotergen mit der Folge, dass die Genexpression gesteigert ist. Mutationsträger haben somit eine erhöhte Prothrombinkonzentration, heterozygote Träger um 30 % und homozygote Träger um 70 % im Vergleich zum Wildtyp. Personen mit dieser Mutation sind in einem hyperkoagulabilen Status, das Thromboserisiko ist bei Heterozygotie auf das 2-5-fache und bei Homozygotie auf das 10-fache erhöht.
Indikation zur Untersuchung auf Prothrombinmutation (G20210A):
LAMP (Loop mediated Amplification) ist eine DNA-Amplifikations-Technik, die eine isothermale Nukleinsäureamplifikation verwendet, sodass der Nachweis einer Zielsequenz ohne Thermocycler erfolgen kann, wie es bei konvenzionellen PCRs oder real-time PCRs von Nöten ist. Im Rahmen der LAMP wird die Zielsequenz bei einer konstanten Temperatur von 65 °C amplifiziert. Es werden 3 Primerpaare benutzt, sowie eine Polymerase, die neben der Replikationsaktivität auch eine hohe Strangverdrängungsaktivität hat. Es werden 6 verschiedene Primer verwendet, um 8 verschiedenen Regionen des jeweiligen Zielgens zu identifizieren, was die Spezifität erhöht. Aufgrund der spezifischen Wirkungsweise dieser Primer ist die produzierte DNA-Menge erheblich höher als bei der konventionellen PCR-basierten Amplifikation. Die Pyrophosphat-Freisetzung führt zur Prezipitation, was als Trübung erkennbar ist.
Das Lamp Human prothrombin mutation KIT (rs1799963) erhält 6 spezifische Primer, die eine loop-mediated Amplifikation der spezifischen Region, die den FII G20210A-Polymorphismus umgibt, ermöglichen. Jede amplifizierte Zielsequenz wird mittels mutationspezifischer Sonde durch die Detektion von Fluoreszenz-Quenching detektiert. Nach der Amplifikation wird die Temperatur auf 40 Grad erniedrigt, wobei die Sonde an die amplifizierte Zielsequenz hybridisiert. Reporter und Quencher Farbstoff stehen in unmittelbarer Nähe zueinander, was zum Quenching der Fluoreszenz führt.
Zur Erstellung der Schmelzkurve wird die Temperatur bis 90°C erhöht und die Fluoreszenzemission wird über die Zeit gemessen. Das amplifizierte DNA-Fragment stimmt nicht perfekt mit der mutation-spezifischen Sonde überein. Vom Wildtyp-Fragment wird die Sonde deswegen bereits bei niedrigeren Temperaturerhöhungen freigesetzt als vom amplifizierten mutierten DNA-Fragment. Dies resultiert in zwei verschiedenen Fluoreszenzsignale bei unterschiedlichen Temperaturniveaus, was die Differenzierung zwischen homozygot mutiertem, heterozygot mutiertem Genotyp und dem Wildtyp des Faktor II Gen-Fragments möglich macht.
Gerät: LC-Genie III v3.17
Kit: Lamp Human prothrombin mutation KIT (rs1799963) (Fa. LaCar)
Das Untersuchungsmaterial sollte so schnell wie möglich zum Labor transportiert werden.
Gendiagnostikgesetz (GenDG)
Das GenDG fordert für alle genetischen Untersuchungen eine ausführliche Aufklärung des Patienten sowie eine schriftliche Einwilligung.
GenDG.pdf (labormedizin-krefeld.de)
Die Untersuchung erfolgt außerhalb der Akkreditierung.
Beurteilung:
Die Punktmutation an der Position 20210 (G – A) auf dem menschlichen Prothrombin Gen wird nachgewiesen.
Eine Differenzierung zwischen heterozygoter und homozygoter Mutation mittels LAMP ist gegeben und somit eine Einschätzung des Thromboserisikos.
Literatur: