HIV-1-RNA (RT-PCR)

Indikation

 
Das HI-Virus ist ein Retrovirus mit den Subtypen HIV-1 und HIV-2. Die Infektion wird parenteral, vertikal (pränatal, perinatal, postnatal durch Stillen) und über ungeschützten Geschlechtsverkehr übertragen. Das höchste Infektionsrisiko besteht in der ersten Woche nach der Infektion und im AIDS-Stadium und korreliert mit der Viruslast. Die Infektion findet über den CD4-Rezeptor und die Ko-Rezeptoren CCR5 und CXCR4 statt, an welche das Virus mit dem Oberflächeprotein gp120 bindet. Zu den Wirtszellen zählen Immunzellen, wie T-Helferzellen, Monozytäre Zellen, Mikrogliazellen des ZNS und Zellen des Gastrointestinaltrakts.
Die Infektion gliedert sich in drei Stadien: Das Stadium 1, die akute Infektion, beginnt ca. 3 Wochen nach der Infektion mit grippeähnlicher Symptomatik und Lymphadenopathie, welche für ca. 2 Wochen anhält.
Das Stadium 2, die Latenzphase, ist gekennzeichnet durch intermittierende unspezifische Symptomatik und verläuft über Monate bis Jahrzehnte. Das Virus wird durch das eigene Immunsystem eingedämmt, während die Anzahl der T-Helferzellen langsam abnimmt. Das Stadium 3, AIDS, ist gekennzeichnet durch definierte opportunistische Erkrankungen und Malignome und kann nach der Anzahl der CD4+ T-Helferzellen/µl in drei CDC-Stadien unterteilt werden.

Mittels serologischer Methoden wird die HIV-Infektion diagnostiziert. Der Nachweis von HIV-RNS mittel RT-PCR ist in folgenden Situationen indiziert:

• Bestätigung der Diagnose im "diagnostischen Fenster"
• Abklärung unklarer Antikörperbefunde
• Kinder HIV-infizierter Mütter im ersten Lebensjahr.
• Vor Beginn einer Anti-Retroviralen Therapie
• Überprüfung einer Wirksamkeit der Anti-Retroviralen Therpie
• Blutspender 

Methode

 

Polymerase Kettenreaktion:

Quantitatives Testverfahren: VERSANT HIV-1 RNA Assay

Der VERSANT HIV-1 RNA Assay 1.5 (kPCR) ist ein Verfahren zur Durchführung einer reversen Transkription (RT) und kinetischen Polymerase-Kettenreaktion (kPCR) für die Quantifizierung von HIV-1-RNA im Humanplasma.
HIV-1-RNA wird aus dem viralen Kapsid freigesetzt. Die freigesetzte HIV-1-RNA bindet an magnetische-Beads aus Siliciumdioxid. Verbleibenden Plasma-Komponenten werden durch eine Reihe von Waschgängen entfernt. Die gereinigte RNA wird eluiert, auf eine PCR-Platte mit HIV-1 Primer/Sonden-Mix und HIV-1-Enzym-Mix aufgetragen. Die HIV-1-Zielsequenz wird amplifiziert und mithilfe der kPCR-Methode nachgewiesen. Die eingesetzten Sonden enthalten fluoreszierende Farbstoffe und Quencher. Während der Extensionsphase der PCR wird ein Teil der hybridisierten Sonde durch die Exonuclease-Aktivität der Polymerase gespalten. In der Lösung ist die Fluoreszenz kontinuierlich messbar. Der Fluoreszenzanstieg korreliert mit der Menge des erzeugten Amplifikates und ist proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen HIV-1-RNA. 

Qualitatives Testverfahren: HIV-1-RNA TaqMan RT-PCR (Dual Target)

Die RT-PCR dient dem Nachweis von HIV-RNA im Serum oder Plasma. Der Nachweis wird in Form eines Dual-Target Verfahrens geführt, wobei ein Genabschnitt im gag-Bereich und einer im LTR-Bereich amplfiziert wird.
Die Amplifikation und Detektion basiert auf dem TaqMan-Format.
Extrahierte RNA wird in einem Reaktionsansatz zunächst revers in die entsprechende cDNA transkribiert und diese wird anschließend mittels PCR amplifiziert. Während des Annealings hybridisieren sowohl die beiden spezifischen PCR-Primer als auch eine, für dieses Detektionsverfahren erforderliche, spezifische fluorogene Sonde am nachzuweisenden Genom. Im gleichzeitig ablaufenden Extensionsschritt (Zwei-Schritt-PCR) wird diese Sonde von der 5’-3’Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase gespalten, wodurch das Fluoreszenzsignal ansteigt. Übersteigt das Messsignal einen von der Software des Gerätes berechneten cut-off Wert, so gilt die Probe als "positiv" und der entsprechende PCR-Zyklus, in dem die Fluoreszenz diesen "threshold" übersteigt, wird als "threshold cycle" C_Tdefiniert.

Geräte: 7500 Real Time PCR System (ABI); Siemens Versant kPCR System

Material

• Plasma (EDTA)
• Serum
• Liquor

Präanalytik

Das Untersuchungsmaterial sollte taggleich zum Labor transportiert werden. Proben werden direkt nach Probeneingang wenn möglich bearbeitet. Gelagert  wird Probenmaterial bei -20 °C. 

Therapeutischer Bereich

CD4+ T-Lymphozytenzahl und HIV-RNA sollten bei Diagnosestellung und anschließend in zwei- bis drei- monatigen Abständen bestimmt werden. Therapieeinleitung und -umstellung erfordern u. U. kurzfristigere Kontrollen. Nach Reduktion der HIV-RNA durch die Therapie unter 50 HIV-RNA Kopien/ml sind Kontrollen alle 2-4 Monate empfohlen. Ein Wert unterhalb von 50 Kopien/mL sollte nach etwa drei bis vier Monaten, bei initial sehr hoher Plasmavirämie spätestens nach sechs Monaten erreicht werden. Ein Abfall der HIV-RNA um weniger als 2 log10 nach vier Wochen oder eine HIV-RNA >50 Kopien/ml nach sechs Monaten sollten Anlass sein, die ART zu überprüfen und evtl. umzustellen. Die Therapie muss ebenfalls bezüglich eines Therapieversagens evaluiert werden, wenn die Plasmavirämie bestätigt auf über 50 Kopien/mL ansteigt.  
Bei virologischem Therapieversagen sollte eine genotypische Resistenzanalyse aller für die Therapieentscheidung relevanten viralen Genomabschnitte erfolgen (Fremdleistung). 

Verfahrenskenndaten

VERSANT HIV-1 RNA Assay:
Lower Limit of Quantification (LLoQ): 37 Kopien/ml (80 IU/ml)

HIV-1-RNA TaqMan RT-PCR (Dual Target):
Limit of Detection (LOD) 95 %: 263 IU/ml
Limit of Detection (LOD) 50%:    60 IU/ml

Sonstiges

Infektionsschutzgesetz:

Der positive Nachweis einer HIV-Infektion ist entsprechend Infektionsschutzgesetz meldepflichtig (nicht namentlich) an das Robert-Koch-Institut.

Literaturangaben:

• 4. Robert-Koch-Institut: HIV-Infektion/AIDS, RKI-Ratgeber für Ärzte. Robert-Koch-Institut. Stand November 2018.

• AMWF Leitlinie HIV-Infektion, antiretrovirale Therapie (Registrier-Nr. 055-001)

• Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie
  (Hrsg.: S. Suerbaum, G-D. Burchard, H.E. Kaufmann, T.F. Schulz)
  Springer Verlag 2020 9. Auflage